ME-344 × гем-оксигеназа-1 человека

Молекулярный докинг с контролем на induced fit; подготовка белковой модели и лиганда

9 сентября 2026 · smina (Vina 1.1.2) + AutoDock Vina 1.2.5 · RDKit 2026.03.1 · 3 ч 45 мин CPU

Это генерация гипотезы, а не установленный сайт связывания

Экспериментально сайт связывания ME-344 на HO-1 не определён: нет ни кристаллической структуры комплекса, ни докинга в литературе, ни мутагенеза, ни HDX-картирования. Всё ниже — расчёт на жёстком рецепторе с эмпирической scoring-функцией. Ни одно число здесь не является измеренной аффинностью. Читайте раздел «Оговорки» до того, как ссылаться на любую цифру.

Интерактивный просмотр

Все структуры сведены в одну систему координат (цепь A 1N45) кабш-суперпозицией по 214 общим Cα — тем же преобразованием, которым переносились боксы, так что картинка и числа согласованы по построению. Мышь: вращение — ЛКМ, зум — колесо, сдвиг — ПКМ.

Гем (коричнево-оранжевый) удерживается His25 с проксимальной стороны; каталитическая дистальная вода (красная сфера) сидит в 2.04 Å от железа. Именно её вытесняют азольные ингибиторы — и именно этот гем остаётся на месте при связывании ME-344, потому что ингибирование неконкурентно по гемину.

загрузка структур…

белок (лента) остатки кармана гем дистальная вода AD8 (3CZY) QC-308 (3TGM) ME-344 (в 3TGM) ME-344 (в 3CZY) ME-344 (1N45, клеш) ME-344 (blind)

Расстояния, измеренные в этом наложенном кадре, могут отличаться от приведённых в тексте на пару десятых Å: количественные значения в таблицах считались в родном кадре каждой структуры, а суперпозиция имеет собственный RMSD (0.51 Å для 3TGM, 0.74 Å для 3CZY). Исходные координаты — в data/.

Постановка задачи

ME-344 — изофлавон второго поколения, активный деметилированный метаболит NV-128, родственный фенокседиолу; прошёл клинические фазы 1/1b. Среди его мишеней показана гем-оксигеназа-1 (Zhang et al., Cancer Res 2019): IC₅₀ 17.6 нМ на очищенном ферменте против 11.0 нМ у эталонного SnPPIX.

Критично для постановки расчёта — ингибирование неконкурентно по гемину (K_M 5.5 мкМ): гем не вытесняется. Поэтому гем сохранён в составе жёсткого рецептора во всех вариантах, а не удалён.

Второе ключевое обстоятельство: у ME-344 нет азольного кольца. Все охарактеризованные кристаллографически ингибиторы hHO-1 (азалантстат/QC-1, QC-80, QC-308) якорятся координацией железа гема атомом азота азола. ME-344 такой якорь недоступен — что и составляет открытый вопрос.

Главный результат: контроль на induced fit

Один и тот же лиганд, один и тот же протокол, разные конформации дистального кармана:

Рецептор	Состояние кармана	Мод / 20	Лучший, ккал/моль	Разброс по 5 сидам
`1N45`	без ингибитора (нерасширен)	1–4	−4.06	—
`3CZY`	раскрыт лигандом AD8	7–8	−7.84	0.03
`3TGM`	раскрыт QC-308 (самый объёмный)	1–3	−9.43	0.007
позитивный контроль: передок самого AD8 в свой же карман 3CZY — 19/20 мод, −7.54

Решающая улика — не скор, а число возвращённых поз. У smina запрашивали 20 различных мод. В нерасширенном кармане 1N45 движок нашёл одну–четыре, при 20/20 в blind-боксе по всему белку. Минимальный контакт лучших дистальных поз — 2.57 Å, это область стерического клеша (норма ван-дер-Ваальса ≈3.4–3.9 Å), а медианный скор −0.29 ккал/моль, то есть фактически ноль. Лиганд физически не помещается.

После раскрытия кармана ME-344 набирает лучше, чем передок самого азольного ингибитора в его собственную структуру (−9.43 / −7.84 против −7.54).

Где именно он садится (3TGM, лучшая поза)

центроид от Fe: 7.5 Å (кристаллический QC-308 — 7.4 Å)
смещение от центроида кристаллического лиганда: 0.41 Å
перекрытие объёма: 25 из 26 тяжёлых атомов в пределах 2 Å от атома кристаллического лиганда
контакты <3.5 Å: Asp140 (2.7), Gly139 (2.9), Met34 (3.1), Asn210 (3.1), Leu213 (3.2), Phe167 (3.2), Leu147 (3.2), гем (3.2), Arg136 (3.3)

Asp140 и Gly139 — ровно те остатки, чью упорядоченную водородную сеть и каталитическую дистальную воду разрушают азольные ингибиторы.

Модель, которую это поддерживает

ME-344 занимает дистальный гидрофобный карман — сайт «западного региона» азольных ингибиторов — без координации железа гема (центроид в 7.5 Å от Fe). Это согласуется одновременно со всеми тремя опубликованными наблюдениями: неконкурентность по гемину (гем остаётся, лиганд сидит над ним с дистальной стороны), конформационное изменение фермента (сайт требует induced fit) и тушение флуоресценции триптофанов.

Слепой докинг дал артефакт, и это важно проговорить. Blind-бокс по всему белку воспроизводимо во всех 5 сидах клал лучшую позу (−7.83) в 6.6 Å от железа, в контакте с Lys18 (2.92 Å), пропионатом гема, Lys22, Glu29 и His25 — то есть на участке связывания цитохром-P450-редуктазы, картированном мутагенезом (Wang & Ortiz de Montellano, JBC 2003). Соблазнительная гипотеза — но blind гоняли на 1N45, где настоящий карман закрыт, и лиганд просто вытеснило на ближайшую заряженно-гидрофобную поверхность. Это артефакт конформации рецептора, а не находка.

Подготовка белковой модели

Выбор структур

PDB-коды разрешены по первоисточникам через RCSB search по UniProt P09601 (26 записей) и по primary-citation каждой работы — ни один код не угадан.

PDB	Разрешение	R / R-free	Лиганды цепи A	Роль
`1N45`	1.50 Å	0.151 / 0.217	`HEM` A300	основной рецептор (holo, без ингибитора)
`3CZY`	1.54 Å	0.194 / 0.226	`HEM` + `AD8` A901	контроль передока, дистальный бокс
`3TGM`	2.85 Å	0.223 / 0.264	`HEM` + `3TG` (QC-308)	геометрия раскрытого кармана

1N45 — прямой преемник депозиции Schuller/Wilks/Ortiz de Montellano/Poulos 1999 г. (исходный 1QQ8 снят, запись RCSB указывает id_codes_replaced_by: [1N45] и тех же четырёх авторов).

Почему 3CZY, а не 3HOK для контроля передока: в 3HOK ингибитор Q80 присутствует только в цепи B, и рецептор из цепи A остался бы вообще без лиганда.

Сборка рецептора

Только цепь A. RCSB assembly-эндпоинт даёт oligomeric_details: monomeric для всех трёх структур — две цепи в асимметричной ячейке кристаллографические копии, не биологический димер. Altloc: оставлены только ' ' и 'A' (1745 из 1748 атомов).
Гем сохранён целиком — все 43 атома HEM A300 входят в жёсткий рецептор. Этого требует неконкурентный механизм.
Ко-кристаллизованный ингибитор удалён из рецептора и сохранён отдельно как эталонный лиганд для передока.
Криопротектант и буферные компоненты (SO4, HEZ) отброшены.
Неупорядоченные петли одинаковы во всех структурах: остатки 1–9 и 224–233 (конструкт Δ233-hHO-1, смоделирован диапазон 10–223). Внутренних разрывов нет.

Каталитическая дистальная вода

Ближайшие воды к железу цепи A в 1N45 (Fe в 18.585 −0.110 4.173):

HOH 301  d=2.04 Å  xyz=[18.814  1.187  2.610]  occ=1.00  B=40.2   ← дистальная аксиальная
HOH 444  d=4.65 Å
HOH 314  d=5.80 Å

His25 — проксимальный лиганд (His25 NE2 ··· Fe = 1.99 Å), следовательно HOH A301 на 2.04 Å и есть каталитически критичная дистальная вода. Собраны два варианта рецептора — с ней и без.

Независимое координатное подтверждение механизма вытеснения: после суперпозиции комплексов на 1N45 центроид имидазольного кольца азола ложится практически на позицию этой воды —

3CZY AD8 имидазол → d(HOH301) = 0.94 Å ;  d(Fe) = 2.39 Å
3TGM 3TG имидазол → d(HOH301) = 1.26 Å ;  d(Fe) = 2.46 Å

В 3CZY ближайшая вода к железу вообще в 5.83 Å — дистальной воды там просто нет.

Конверсия в PDBQT и проверка железа

obabel -ipdb rec_*.pdb -opdbqt -O rec_*.pdbqt -xr

Железо переживает конверсию с корректным типом (Fe в колонке типа AutoDock), координаты бит-идентичны входу. Но «пережило» ≠ «оценивается разумно», поэтому это проверено отдельно — скоринг кристаллической позы AD8 против рецептора 3CZY с одним атомом Fe и без него:

Терм	с Fe	без Fe	Δ	вес	Δ×вес
gauss(o=0)	74.189	72.186	2.003	−0.0356	−0.071
gauss(o=3)	1072.969	1067.452	5.517	−0.0052	−0.028
repulsion	4.820	3.930	0.890	+0.8402	+0.748
hydrophobic	39.957	39.957	0	−0.0351	0
non_dir_h_bond	1.000	0.000	1.000	−0.5874	−0.587
нетто					+0.060

Scoring-функция штрафует связь азол–железо. Железо распознаётся как металл-донор и даёт ровно 1.0 в терм non_dir_h_bond (−0.59 ккал/моль). Но штраф отталкивания за короткий контакт Fe···N (+0.75) перевешивает, и образование координационной связи стоит +0.060 ккал/моль. То есть Vina-семейство активно, пусть и слабо, не любит ровно то взаимодействие, которым якорится каждый известный азольный ингибитор hHO-1.

Обходной путь не применялся к рецептору — ограничение задокументировано и обойдено аналитически: гем оставлен нетронутым (ремаппинг типа, как в прецеденте Ir→Fe, здесь не нужен и был бы неверен — у Fe свой тип есть); прогоны идут в 5 сидах с 20 сохранёнными модами; и любая поза ME-344, касающаяся железа, считается ненадёжной. Для ME-344 это ограничение менее опасно, чем для азолов, — координировать железо ему нечем.

AutoDock Vina 1.2.5 типизирует то же железо согласованно: та же поза оценена в −5.203 против −5.200 у smina.

Подготовка ME-344

Идентичность соединения

ME-344 = (3R,4S)-3,4-бис(4-гидроксифенил)-8-метил-3,4-дигидро-2H-хромен-7-ол. Структура не принята на веру, а верифицирована:

брутто-формула: C22H20O4 ✓
молекулярная масса: 348.40 ✓
InChIKey: QVCAATSEPLQVBX-FPOVZHCZSA-N
PubChem CID: 68026984 — точное совпадение InChIKey
SMILES: Cc1c(O)ccc2c1OC[C@@H](c1ccc(O)cc1)[C@H]2c1ccc(O)cc1

Нумерация хромана проверена отдельно — сопоставление индексов атомов RDKit позициям хромана делалось по SMARTS [#8;R]1[CH2;R][CH;R][CH;R]c2ccccc21, и самопроверка независимо воспроизвела заявленный паттерн замещения: C7 несёт OH, C8 несёт CH3 степени 1, стереоцентры — C3 и C4.

Перебраны все 4 стереоизомера от двух неопределённых центров с назначением CIP-меток через rdCIPLabeler; выбран (3R,4S), чей InChIKey совпал с PubChem-записью, носящей имя ME-344, и чьи CIP-метки PubChem подтверждает независимо.

Расхождение по CAS — оставлено неразрешённым, а не «улажено». Часто пишут, что 1374524-55-6 и 1374524-68-1 — это пара энантиомеров. PubChem показывает другое: 1374524-68-1 → CID 68026984, стереоопределённое (3R,4S), синонимы включают ME-344, UNII 843G0TDV51; 1374524-55-6 → CID 66563165, та же конституция без стереодескрипторов, и синонима ME-344 у неё нет вовсе. Записи для (3S,4R)-энантиомера не нашлось ни под одним из CAS. Практический вывод: покупка по CAS 1374524-55-6 сама по себе не гарантирует единственный стереоизомер (3R,4S) — уточняйте у поставщика.

Конформеры

ETKDGv3, seed 42, 50 конформеров, без прунинга
MMFF94: 50 сошлись, 0 не сошлись
диапазон энергий: 54.663 .. 58.144 ккал/моль
уникальных после MMFF (best-RMS 0.3 Å): 2 из 50
вращаемых связей: 5  (TORSDOF 5)
InChIKey, перевоспринятый из 3D: QVCAATSEPLQVBX-FPOVZHCZSA-N — совпал с 2D

Стереохимия перевоспринята из 3D-координат после эмбеддинга и оптимизации — конфигурация (3R,4S) пережила генерацию конформеров.

Показательно, что различны лишь 2 конформера из 50: хромановое ядро жёсткое, а два пара-замещённых арила топологически симметричны при best-RMS, так что их ротамеры схлопываются. Конформационная гибкость реально низкая — для надёжности докинга это хорошо.

Валидация протокола

Передок ко-кристаллизованного азольного ингибитора в собственный карман — по верхнему рангу провалился: RMSD 2.703 Å. Диагноз важнее числа:

сэмплирование воспроизводит кристаллическую позу до 0.72–1.01 Å во всех 5 сидах;
но первое место она занимает лишь в 2 сидах из 5, при разбросе всего 0.048 ккал/моль;
все неверно ранжированные «победители» сидят в 3.99–4.51 Å от железа против кристаллических 2.06 Å — ровно та подпись, которую предсказывает измеренный выше штраф на Fe.

То есть рецептор, бокс и обработка железа валидны, а ранжирование Vina вблизи гема — нет. Отсюда протокол: 5 сидов × 20 мод, чтение только по кластерам, никогда по единственной верхней позе.

Независимая корроборация геометрии бокса: fpocket на holo-рецепторе ставит карман №1 из 27 (score 0.439, druggability 0.919, объём 413 Å³) в 1.0 Å от центра дистального бокса, полученного совершенно другим способом — из центроида адамантановой группы кристаллического AD8.

Оговорки

Cross-docking bias. 3TGM — это карман, отлитый под QC-308; высокое перекрытие с QC-308 частично гарантировано конструкцией. Более независимое свидетельство — 3CZY: другой, меньший лиганд, смещение центроида 7.48 Å; оно говорит, что ME-344 связывается с этой областью вообще, но не воспроизводит позу.
Скоры разных рецепторов не сопоставимы строго.
1–3 моды из 20 в 3TGM — очень тесная посадка; малые ошибки рецептора значимы.
Жёсткий рецептор. Дистальная спираль hHO-1 документированно гнётся и расширяет карман; жёсткая модель этого воспроизвести не может. Именно поэтому провал в 1N45 сам по себе ничего не доказывал.
Дистальный и «вторичный проксимальный» карманы — смежные подсайты одной полости (центры в 3.62 Å), а не независимые сайты; считать их за два свидетельства нельзя. Здесь же поправка к распространённой формулировке: все 22 атома QC-308 лежат на дистальной стороне, «двойной зажим» — это два фенила одной молекулы, а не вторая копия у грани His25.
Blind-бокс 59×50×59 Å — далеко за пределами объёма, где поиск и скоринг Vina надёжны. Только генерация гипотез.
Участок CPR-интерфейса — плоская поверхность, не полость: ни один из 18 карманов fpocket с ним не совпадает (ближайший центр в 8.83 Å). Докинг в принципе не может валидировать разрушитель белок-белкового интерфейса.
Неконкурентная кинетика сама по себе не локализует сайт. Она исключает конкуренцию с гемином — но ME-344 мог бы действовать и в дистальном кармане, и на интерфейсе с редуктазой, и аллостерически, и опосредованно. Докинг ранжирует гипотезы, но не выбирает между ними.
Геометрия 3TGM взята из структуры 2.85 Å с 14 упорядоченными водами — самой низкокачественной из использованных.
PDB-запись для работы J Inorg Biochem 2010 (PMID 19917515) не разрешена — её DOI отсутствует в цитатном индексе PDB. Замена не подставлялась.
Протонирование — дефолты Open Babel при нейтральном pH, расчёта pK_a не делалось. Три фенола ME-344 нейтральны (разумно при pH 7.4, pK_a фенола ≈10); состояния His/Asp/Glu вручную не курировались. Парциальные заряды нулевые — для атом-типовой функции Vina это безразлично.
Одна цепь, один конформер. Ансамблевого докинга по нескольким кристаллическим формам hHO-1 не делалось; конформационная гетерогенность рецептора не просэмплирована.

Что это предсказывает — два различающих эксперимента

Ценность расчёта не в цифрах, а в том, что он делает гипотезу фальсифицируемой:

Полоса Соре. Если модель верна и железо не координируется, ME-344 не должен давать гексакоординационный сдвиг, характерный для азолов. Часы работы, однозначный ответ.
Конкуренция с QC-308 / азалантстатом. Один и тот же сайт предсказывает конкуренцию между ингибиторами при том, что оба остаются неконкурентными по гему. Нетривиальное и проверяемое утверждение — SPR или активностный формат.

Третий, бьющий по альтернативной гипотезе: реконструкция с цитохром-P450-редуктазой ± ME-344 — падает ли перенос электронов при сохранной посадке гема.

Воспроизводимость

движки: smina (сборка на Vina 1.1.2), AutoDock Vina 1.2.5
химия: RDKit 2026.03.1, Open Babel, fpocket
параметры: exhaustiveness 32, num_modes 20, сиды 1 / 7 / 42 / 123 / 2024
прогонов: 31 продакшн + 11 контрольных на induced fit

Полные логи, координаты боксов с провенансом каждого центра, вывод fpocket, все команды и их вывод — в рабочем каталоге проекта (NOTES.md, 629 строк, 13 пронумерованных оговорок; boxes.json; RESULTS.md).

Первичная литература по механизму ME-344 и по ингибиторам/структурам HO-1 загружена в архив TAMA — коллекция «ME-344 / HO-1 Mechanism 2026», 20 статей.